单酶・one-step法迅速・高性能Realtime PCR试剂

one-step qRT-PCR Kit RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix 系列

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价格表

RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
QRT-101 500μl×5支(100次份) RMB 2,000 -20℃ 产品说明书

RNA-direct™ SYBR® Green Realtime PCR Master Mix

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QRT-201 500μl×5支(100次份) RMB 2,000 -20℃ 产品说明书

用途

Realtime RT-PCR

说明

Tth DNA polymerase是在Mn2+在下,具有很强的逆转录活性的独特的酶,在单一反应体系内可进行cDNA的合成及PCR的连续反应。利用该特性,开发出单酶一步法定量PCR试剂盒,与在同一反应中使用RTase及Taq DNA polymerase的两酶一步法体系试剂相比,使用单酶时,最适反应条件的设定较容易,而且能够得到更高的分析效率。


 

特征

步法高量分析
本品以 RNA 为模板,能够在同一反应体系内进行定量PCR分析非常适合于需要快速分析的多重检测体系


特异性高
本品采用抗体法热启动,对控制非特异性扩增非常有效。


适用性广
探针法及SYBR® Green I 法都可以适用


用于不同类型的仪器
为含有参比染料(Passive reference),可适用于需要校正的检测仪器(如Applied Biosystems® StepOnePlusTM 等)


可用于易于形成高级结构的 RNA 和高 GC 含量的模板
可用于使用玻璃毛细管的检测仪器(如Roche Diagnostics公司LightCycler® )
逆转录反应在高温下进行,所以也适用于易于形成高级结的模板RNA而且,众所周知,Tth DNA polymerase对GC含量高的序列的扩增效率非常高,可有效检测GC含量高的目的片段。

 

实验例

1. 两步法体系(RTase + Taq)』关性的比较

通过以各种人组织来源的RNA为样品,对蛋白δ(PKCδ)的表达进行分析,比较了与使用一般的两步法的荧光定量PCR分析法的相关性。
黄色柱状图表示的是使用本产品的定量结果,左边是使用50ng、右边是使用200ng的Total RNA得到的结果。蓝色柱状图表示的是使用本公司高效率逆转录试剂盒「ReverTra Ace -α-®[FSK-101]与Taq酶为基础的荧光定量PCR试剂SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus-」[QPK-212]组合的两步法体系检测的结果。

结果显示,使用一步法的本产品与两步法体系得到了相同的结果。



2. TaqMan® 探针法分析的性能比较

RNA-directTM 与两酶一步法(仪器:使用BioFlux公司 Line Gene)
以mRNA为模板,与使用Taq+RTase混合型的A公司的试剂(两酶一步法体系)进行了比较实验。
以人培养细胞提取mRNA(10n稀释系列(n=2))为模板,用TaqMan® 探针法对β-actin的mRNA进行检测(作100倍稀释,使用20μl反应液中含有5ng的Poly(A)+ RNA)。结果显示,使用RNA-directTM Realtime PCR Master Mix的反应中,即使使用A公司试剂推荐的反应条件,也会得到起峰早及直线性的良好结果。




3. SYBR® Green分析中直线性的讨论

RNA-directTM 与两酶一步法(仪器:使用ABI公司PRISM® 7900HT)
以HeLa细胞来源的Total RNA(10n稀释系列(n=2))为模板,用SYBR® Green分析法检测β-actin的mRNA(作100倍稀释,使用20μl反应液中含有75ng的Total RNA)。
结果显示,与Taq+RTase混合型的B公司试剂盒相比,RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix的反应中,至少可以在7个梯度的稀释系列中表示出高度相关性。



4. SYBR® Green分析法中性能的比较

RNA-directTM 与一酶一步法(仪器:使用Roche公司 LightCyclerTM)
以人培养细胞提取的Poly(A)+RNA(10n稀释系列(n=2))为模板,用SYBR® Green分析法检测G3PDH 的mRNA (作100倍稀释,使用20μl反应液中含有5ng的Poly(A)+ RNA)。
结果显示,与同样使用Tth DNA Polymerase的C公司试剂相比,RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix的检测中,起峰早、信号强以及检测灵敏度都得到了极大提高。






 

参考文献

T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)

产品内容

〈QRT-101, QRT-201〉
Master Mix0.5ml ×5支
50mM Mn(OAc)20.5ml ×1支
(50μl反应体系可使用100次,20μl反应体系可使用250次)


保存 -20℃(避光保存)

基本反应条件

〈SYBR® Green I 法〉
使用ABI PRISM®7900HT(Applied Bio.)
灭菌水X μl
Master Mix25μl
50mM Mn(OAc)22.5μl
各Primer10pmoles each
RNA样品<1μg

Total Volume50μl


Cycle
90℃    30sec.
61℃    20min.
        ↓
95℃    60sec.
        ↓
95℃    15sec.
*55~65℃    15sec. 45cycles
74℃    45sec.

※退火温度,请根据引物的Tm在55~65℃范围内进行调整。

备注

LightCycler® 是Idaho Technology Inc.的商标。
SYBR® 是Molecular Probes Inc.注册的商标。
TaqMan® 是Roche Molecular Systems Inc.注册的商标。
ABI PRISM® 是Applied Biosystems® Inc.注册的商标。

几点建议

●保存
长期保存时,推荐-20 ℃ 避光保存。但是,如果在短期内需持续使用时,可于4 ℃ 避光保存3周左右。


逆转录反应的引物

PCR的Reverse Primer可以直接当作逆转录引物使用。
无需另外添加。另外,不能使用Oligo dT或Random Primer


样品的添加量
用10μl等少量反应体系进行反应时,样品不要以1μl这样极少量的水平添加,可通过稀释后添加2μl左右的量这样可以抑制液器误差,得到良好的结果。


关于参比染料(passive reference
预先混合。可以培养板型PCR仪器上直接使用。
另外不使用参比染料(passive referencePCR仪器也没有影响。


关于锰离子溶液
RNA-directTM Realtime PCR系列中,另外单独添加了一管足够量的醋酸锰溶液 (橙色标签)


FAQ请点击这里

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