具有连接DNA片段及Nick位点活性的酶。

T4 Phage来源的DNA连接酶 T4 DNA Ligase

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价格表

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LGA-111 400U×1支 RMB240 -20℃ -

用途

●DNA片段及Nick的连接

用于将目的基因插入到载体中,以及向DNA片段附加linker等的反应。

说明

T4 DNA Ligase通过磷酸二酯键连接相邻的DNA的5'磷酸根末端和3'羟基末端,需要有Mg2+和rATP。
作用于平滑末端及突出末端双链DNA、或带有Nick的双链DNA,但对RNA与RNA的连接以及RNA与DNA的连接几乎不起作用。
连接反应速度因DNA末端的形状及碱基序列不同而异。


 

特征

 

实验例

DNA末端形状不同时反应性能的比较

使用不同限制性酶酶切后的DNA片段,讨论了DNA末端形状不同时T4 DNA Ligase反应性能的差异
5'末端浓度为0.1μM,用不同酶量,在16℃条件下反应1hr.后,电泳分析结果如A所示同样,5'末端浓度为0.1μM(Hae1.0μM),在16℃条件下改变反应时间,电泳分析结果如B所示
结果可见:平滑末端DNA突出末端DNA相比,连接效率较低。T4 DNA Ligase对于平滑末端DNAKm値比突出末端的DNA的Km值要高出约100倍,因此在平滑末端DNALigation反应中,必须提高 DNA的浓度和Ligase的酶量

 





 

参考文献

1)N. E. Murray et al., J. Mol. Biol.,132: 493(1979)
2)B. Weiss et al., J. Biol. Chem.,243: 4543(1968)

产品内容

T4 DNA Ligase(1-5U/μl)
10×Buffer* [LGA-1B]
*不含rATP。可使用rATP[Code No.ATP-111]。
 

组成:
20mM Tris-HCl (pH7.6)
1mM EDTA
60mM KCl
5mM DTT
50% Glycerol
10×Buffer [Code No. LGA-1B] 组成:
  660mM Tris-HCl (pH7.6)
  100mM DTT
    66mM MgCl2


活性的定义:

在ATP-PPi交换反应中,在37℃、pH值7.6下,在20分钟内交接1nmole的32PPi时所需要的酶量为1U。
本酶1U(Weiss Unit)相当于125 Ligation Unit。


来源:
E.coli 重组体


纯度:
10U的本酶和1μg的λDNA/HindⅢ分解物在16℃下反应20小时,DNA的电泳模式未见变化。
10U的本酶和1μg的super coiled φx174 DNA 在16℃下反应20小时,DNA的电泳模式未见变化。
活性测定条件下,本酶与1μg的E.coli [3H]-DNA的反应中,游离为酸可溶性组分时的放射能活性为0.01%/小时/U以下。
活性测定条件下,本酶与1μg的5’端标记的32P的λDNA/HindⅢ分解物反应,游离为可溶性组分的放射能活性为0.01%/小时/U以下。
 

基本反应条件

<与载体的连接反应>
灭菌蒸留水 Xμl
载体DNA 0.05-0.5μg
插入DNA   3倍于载体的mole数
10×Buffer 2μl
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 0.5-1U(突出末端)
1-5U(平滑末端)
Total Volume 20μl


16℃4-16hr.


<linker连接反应>
灭菌蒸留水 Xμl
DNA 0.1-1μg
linker   10倍于DNA mole数
10×Buffer 2μl
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 1-5U
Total Volume 20μl


16℃8-16hr.


*DNA的浓度、形状、碱基序列及长度不同,效率也发生变化。

几点建议

●平滑末端的连接
平滑末端的连接与突出末端相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末端的连接反应时,可提高DNA浓度,将使用酶量增加到突出末端酶量的2~5倍左右。

 

●反应温度
本酶最适温度为37℃,考虑到连接DNA的末端的杂交效率,通常在16℃进行反应。有时也可在4℃~室温下进行反应。

 

●EDTA
本酶要求有Mg2+存在,因此螯合Mg2+的EDTA对反应有抑制作用。用含有高浓度EDTA的缓冲液溶解DNA作为样品使用时,推荐用灭菌蒸馏水或TE缓冲液替换后再使用。

 

●DNA量
质粒DNA与插入DNA的反应,其摩尔比应调整为1:3。与粘粒或噬菌体进行连接反应时,可使载体和插入片段的摩尔比调整为1:1,同时增大DNA浓度以便取得良好效果(0.05~0.1μg/μl以上)。

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