可用于PCR产物及引物磷酸化的磷酸化酶。

T4 Phage来源的磷酸化酶 T4 Polynucleotide Kinase

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价格表

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PNK-111 1,500U×1支 RMB830 -20℃ -

用途

●DNA linkerDNA片段5'末端的磷酸化
●DNA的5'末端的标记

说明

T4 Polynucleotide Kinase能催化rATP的γ位磷酸根转移到DNA及RNA的5'末端羟基的反应。该反应是可逆的,在rATP或rADP的存在下,也可进行5'末端磷酸交换反应。
磷酸化反应易受底物DNA末端形状的影响,因此反应必须在各自最佳条件下进行。


 

原理

参考文献

1)C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54: 158(1965)
2)A. M. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enzymology, 65: 499(1980)

产品内容

T4 Polynucleotide Kinase(5-20U/μl)
10×Protruding End Kinase Buffer [PNK-1P]
10×Blunt End Kinase Buffer [PNK-1B]
Denaturation Buffer [PNK-1D]
 

组成:
50mM Tris-HCl (pH7.5)
0.1mM EDTA
1mM DTT
50mM KCI
0.1μM ATP
50% Glycerol


10×Protruding End Kinase Buffer [Code No. PNK-1P]组成:
 500mM Tris-HCl (pH8.0)
 100mM MgCl2
 50mM DTT


10×Blunt End Kinase Buffer [Code No. PNK-1B]组成:
 500mM Tris-HCl (pH9.5)
 100mM MgCl2
 50mM DTT


Denaturation Buffer [Code No. PNK-1D]组成:

20mM Tris-HCl (pH9.5)
1mM Spermidine
0.1mM EDTA


活性的定义:
 以用Micrococcal Nuclease活化的小牛胸腺DNA为底物,在37℃、pH7.6下,30分钟内将1nmole的[γ-32P]rATP摄入为酸不溶性沉淀物所需的酶量为1U。


来源:
  E.coli 重组体
 
纯度:
10U的本酶和1μg的λDNA/HindⅢ分解物在37℃下反应20小时,DNA的电泳模式未见变化。
在活性测定条件下,本酶和1μg的[3H]-E.coli DNA进行反应,游离为酸可溶性组分时放射能活性为0.01%/小时/U以下。
 

基本反应条件

<单链5'末端突出的双链DNA的标记>
灭菌蒸馏水   Xμl
底物DNA     5-20pmoles
10×Protruding End
Kinase Buffer  10μl
[γ-32P]rATP(10mCi/ml) 10μl
T4 Polynucleotide Kinase 20U
Total Volume  100μl

37℃, 60min.


<平滑末端3'末端突出的双链DNA的标记>
灭菌蒸馏水 Xμl
底物DNA 5-20pmoles
Denaturation Buffer 75μl
Total Volume 75μl

90℃, 2min.
冰上急剧冷却

add:
10×Blunt End
Kinase Buffer 10μl
[γ-32P]rATP(10mCi/ml) 10μl
T4 Polynucleotide Kinase 20U
Total Volume 100μl

37℃, 60min.
90℃, 2min.


缓慢降至室温
<寡核苷酸的标记>
灭菌蒸馏水 Xμl
底物DNA 10pmoles
10×Protruding End
Kinase Buffer 1μl
[γ-32P]rATP(3000Ci/mmole) 3-6μl
T4 Polynucleotide Kinase 10U
Total Volume 10μl

37℃, 30min.
95℃, 3min.


需要与寡核苷酸等摩尔以上的rATP。
10pmoles相当的各比活性如下所示。
3000Ci/mmole,10μCi/μl 3μl
6000Ci/mmole,10μCi/μl 6μl
10pmoles寡核苷酸的大体量如下所示。
15mer 50ng
17mer 56ng
20mer 66ng
24mer 80ng
27mer 90ng
30mer 100ng
正确的计算式在综合目录中有说明。


在此条件下,可得到约106cpm/pmole以上的标记寡核苷酸。

<5'末端突出的双链DNA的磷酸化>
灭菌蒸馏水 Xμl
纯化的DNA片段1μg
10×Protruding End
Kinase Buffer 5μl
10mM rATP 5μl
T4 Polynucleotide Kinase 5μl (5~20U/μl)
Total Volume 50μl

37℃, 60min.
可根据实验需要进行纯化


<平滑末端及3'末端突出的双链DNA的磷酸化>
灭菌蒸馏水Xμl
纯化的DNA片段1μg
10×Blunt End
Kinase Buffer 5μl
10mM rATP 5μl
T4 Polynucleotide Kinase 5μl (5~20U/μl)
Total Volume 50μl

37℃, 60min.
可根据实验需要进行纯化


<寡核苷酸的磷酸化>
寡核苷酸(50μM) 14μl
10×Protruding End
Kinase Buffer 2μl
10mM rATP 2μl
T4 Polynucleotide Kinase 2μl (5~20U/μl)
Total Volume 20μl

37℃, 60min.
95℃, 5min.

add:
50μl DW

作为10μM 寡核苷酸溶液使用

几点建议

●酶的搅拌
本酶虽然很少因稀释导致活性下降,但是搅拌会使活性变弱。
因此,请尽量避开Vortex等强力搅拌。

 

●PCR产物的磷酸化
PCR产物经常会含有很多夹杂物,所以用本酶进行磷酸化反应时,为提高效率,推荐预先用试剂盒进行纯化。可推荐MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up- 试剂盒。

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