TA克隆效率有了飞跃性地提高。-20℃保存也不会冻结,使用方便。

高效率连接试剂 Ligation high Ver.2

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价格表

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
LGK-201 750μl×1支 RMB 750 -20℃ 产品说明书

用途

DNA连接

说明

本试剂是以T4 DNA Ligase为主体的高效率单管型连接试剂,广泛应用于各种末端DNA的连接反应。通过对原产品进行改良,可简便地用于各种用途。本试剂是在原产品『Ligation high』基础上改良的使用更方便的高效率单管型连接试剂。只需与DNA片段混合,进行短时间反应,即可高效率地进行连接。可广泛用于突出末端、平滑末端及TA克隆等方面。





 

特征


●高效率  
特别是TA克隆效率得到了大幅度的提高。下图是用各公司试剂盒对TA克隆效率的比较。



●即使在-20℃保存也不会冻结
从冷冻柜中取出后可立即使用。右图表示-20℃保存时试剂的状态[原来的产品:Ligation high〈绿〉、本产品:Ligation high Ver.2〈蓝〉]。  



●简便的单管型

使用方法与原有产品一样,只要将试剂和DNA片段混合即可,非常简便。




 

实验例

1.DNA末端形状与连接效率的关系

在16℃条件下反应时,将DNA片段(0.5kb)的克隆效率与末端形状进行比较。结果可见,突出末端的连接约5分钟即可完成,而平滑末端及TA克隆30分钟约完成70〜80%。另外,平滑末端克隆及TA克隆时间超过1小时,到2小时为止,连接效率会逐渐提高。因此当克隆效率比较低时,可将反应时间提高至2小时左右可提高连接效率。




2.使用未经纯化的PCR产物的TA克隆

 将T载体(50ng, 25fmol)和具有良好扩增效率的未纯化PCR产物(用Taq DNA polymerase扩增的0.5kb片段)按照各种比例混合,在该DNA溶液〈7.5μl〉中添加Ligation high Ver.2〈7.5μl〉,在16℃条件下反应30分钟。然后,用10μl反应液对E. coli DH5α感受态细胞〈100μl〉进行转化,用LB/Amp(X-Gal)培养基培养后点克隆数。结果可见,尽量少带入PCR反应液可得到良好的结果。 由于用纯化后的DNA片段可得到高效率,因此当效率低下时,可使用纯化后的PCR产物。 




 

参考文献

1)R. L. Hawkins et al., Current Microbiol., 38: 335-341(1999)

产品内容

Ligation high Ver.2    750μl



※1次使用7.5μl时,可使用100次。

注意事项

●在−30℃以下长期保存,或在冷冻柜的冷气出风口处保存时,可能会产生冻结现象。经实验证明,5次反复冻融不会影响试剂活性,但注意请尽量不要使其冻结。产生冻结时,可用手指捏着离心管使其融解,但注意不要使其升温。


●产生白色沉淀时也可按照上述方法将沉淀溶解后正常使用。

基本反应条件

 载体+插入DNA    7.5μl

Ligation high Ver.2  3.75~7.5μl*

16℃、30min.

向100μl的Competent cell中加入大约10μl的反应溶液,进行转化。



*TA克隆时,用7.5μl进行反应。



※在用电穿孔法进行转化时,请将反应液进行脱盐或乙醇沉淀法对DNA进行纯化。

几点建议

●反应时间
一般推荐16℃、30分钟,但普通的突出末端连接通常只需5分钟即可完成。当平滑末端或TA克隆的反应效率低下时,将反应时间延长至2小时左右通常可提高连接效率。实验例1中有关于反应时间的数据。


●反应液带入
盐的带入会影响到连接反应。在TA克隆时,未经纯化的PCR产物的带入为0.5〜1μl(15μl反应体系)时,可获得很高的连接效率。使用MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up-进行纯化,TA克隆可获得更高的效率。

 
●TA克隆效率
如想获得更高的连接效率,可使用磷酸化的引物进行PCR。

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