高效率单管型连接试剂。只需与样品混合即可,非常方便。

高效率连接试剂 Ligation high

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LGK-101 375μl×2支 RMB 550 -20℃ 产品说明书

用途

DNA连接

说明

本试剂是以T4 DNA Ligase为主体的高效率单管型连接试剂,广泛应用于各种末端DNA的连接反应。通过组分条件的优化,使之对冻结/融解的稳定性和反应效率大大提高。是含有连接反应所需要的rATP・DTT等的单管连接试剂。使用时只需按DNA样品溶液的1/2〜同等量加入Ligation high,就可以得到比单独使用T4 DNA Ligase更好的结果。


 

特征

简便
只需在DNA样品中混入Ligation high,便可进行高效率的连接反应。


高效率
与单独使用T4 DNA Ligase相比,可获得50倍以上的效率。


高稳定性
经实验确认,即使反复冻融50次,也不会降低连接反应的效率。


 

实验例

1.反复冻融时的稳定性

冻融后,按推荐说明书进行连接反应。结果表明:即使反复冻融50次,也不会降低连接反应的效率。 




2. 盐浓度的影响

本实验探讨DNA溶液中所含的盐(NaCl)浓度对连接效率的影响。
将用SacⅠ切断的pBluescript®Ⅱ(5ng)混入不同盐浓度的TE Buffer 5μl中,以观察DNA溶液中所含的盐成分对自连接效率有多大影响。方法如下:在DNA 片段溶液中添加与其等量或一半量的Ligation high,16℃条件下反应30min.,取2μl用于转化,检测出现的菌落数。
结果显示,NaCl浓度越高,连接反应效率越低。
因此,对溶解在限制酶H Buffer等高盐浓度反应液的DNA用于连接反应时,建议先置换成TE buffer。




3.反应时间对PCR产物TA克隆的影响

使用本试剂,将PCR产物插入到T载体中,观察反应时间对实验的影响。实验方法如下:先以λDNA 500bp为目的片段,用rTaq DNA Polymerase进行。将该反应液1μl (约6.4ng)和2μl的T载体(50ng)添加到3μl的Ligation high中,在16℃条件下进行不同时间的温育,再进行连接反应。然后再用各反应液2μl进行大肠杆菌转化,测定白斑和蓝斑的数量。
结果显示,反应时间越长,效率越高,16小时效果最好。2小时以上,蓝斑的数量没有明显变化,而时间越长白斑的数量越多。因此,用Ligation high进行PCR产物的TA克隆时,如想要获得高插入率,建议反应时间在2小时以上,最好是16小时。 


※想在短时间内进行TA克隆时,推荐使用Ligation high Ver.2。 



4. 反应时间的探讨

用λ/HindⅢ酶切,用Ligation high在16℃条件下进行不同长度时间的连接反应,EtOH沉淀后进行电泳。
结果可见,HindIII酶切末端,约5min.即可完成充分的连接反应。 







 

参考文献

1)R. L. Hawkins et al., Current Microbiol., 38: 335-341(1999)


使用本产品的文章
1)H. Kamiya et al., Nucleic Acids Research, 28(7): 1640-1646. (2000)
2)H. Kamiya et al., Biol.Pharm.Bull.,27(5): 621-623(2004)
3)Tatsuya Suzuki et al., AnalyticalSciences, 23(1): 65-70 (2007) 3)P. Blackburn, et al., J. Biol. Chem., 252: 5904-5910(1977)
4)P. Blackburn and B. Jailkhani, J. Biol. Chem., 254: 12488-12493(1979)

产品内容

Ligation high 375μl ×2支


※1次使用15μl时,可使用50次。

注意事项

本试剂中有时会出现沉淀,这是由于作为稳定剂用的BSA形成的,对连接效率没有影响。请勿加温使其溶解,直接使用即可。同时,无须混合使沉淀均质状态,直接将不含沉淀的部分用于反应即可。 

基本反应条件

载体+插入DNA 15μl

Ligation high 7.5~15μl

16℃、30-60min.

向100μl的Competent cell中加入大约10μl的反应溶液,进行转化。



※在用电穿孔法进行转化时,请将反应液进行脱盐或乙醇沉淀法对DNA进行纯化。 

几点建议

●TA克隆时

T载体与PCR产物的连接反应,推荐在16℃反应16小时以上。

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