最适用于合成Realtime PCR用cDNA的逆转录试剂盒。

Realtime PCR用cDNA合成试剂盒 ReverTra Ace® qPCR 系列

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价格表

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
FSQ-201 200次份 RMB 2,000 -20℃ 产品说明书

ReverTra Ace® qPCR RT Kit

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
FSQ-101 200次份 RMB 1,500 -20℃ 产品说明书

用途

Realtime PCR用cDNA的合成

说明

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201)是利用本公司高性能逆转录酶『ReverTra Ace®』开发的Realtime PCR用的逆转录试剂盒,是包含逆转录反应用的所有组分的5×浓度的完全预混型试剂,只需添加模板RNA和水即可迅速地开始反应。另外,由于采用了最适用于Realtime PCR用短链目的片段cDNA合成的反应组分,可在短时间内高效率地制备适用于Realtime PCR的cDNA模板。 



ReverTra Ace®qPCR RT试剂盒(Code No.FSQ-101)采用了本公司高性能逆转录酶『ReverTra Ace®』,反应效率非常出色。另外,通过改良,使得带入到Realtime PCR反应体系中的逆转录反应液的影响降到最小,即使在PCR反应体系中添加20%体积的逆转录反应液,也能表现出良好的扩增线性。因此,最适合用于表达量较少的mRNA的高灵敏度检测。由于精简了试剂盒的构成,可非常简便地进行操作。 







 

特征

可得到更广的可定量扩增区域

将Oligo dT 与Random Primer按最适比例预混,可均一、高效地在RNA全序列范围内进行逆转录,因此可得到更广的可定量扩增区域。


Realtime PCR试剂的配合性良好

采用了对Realtime PCR反应体系影响最小的组分,即使在PCR中添加最多20%的逆转录反应液,也可以得到很高的直线相关性。最适用于表达量少的mRNA的高灵敏度检测。


完全预混型试剂(FSQ-201)

本品为放置于-20℃也不会冻结的完全预混型试剂。只要添加模板RNA和水,就可以简便高效率地合成cDNA,且重复性良好 


容易配制逆转录反应的阴性对照(FSQ-201)

因为添附有相同的预混型no-RT对照,能够方便地配制逆转录反应的阴性对照。

 

实验例

1.模板RNA量的添加量对合成效率影响的探讨

ReverTra Ace® qPCR RT Kit的反应体系(10μl)中,分别添加HeLa细胞来源的total RNA 0.5μg - 0.5pg,分别进行逆转录反应。然后,采用和实验例2同样的方法进行cDNA合成量的比较。结果可见,在探讨的范围内,模板RNA的量和cDNA的得率密切相关,但无论模板RNA量的多寡,仍可维持很高的cDNA合成效率。由此可见,在目的片段浓度有差异的样品之间,逆转录反应效率的变化并不大,因此可将定量结果的误差控制在最小范围内。


 


2.与用其他公司产品cDNA合成量的比较

以来源于HeLa细胞的total RNA 100ng为模板,根据各公司试剂盒推荐的条件进行逆转录反应。然后,在Realtime PCR反应液(使用本公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix)中分别添加上述的逆转录反应液各1% (V/V),用Realtime PCR对β-Actin和Polymerase ε的cDNA量进行定量。结果可见,在使用本试剂盒的情况下,两个目的片段都有最高的得率。 




3. RNase H 处理与否对检测灵敏度影响的比较

以来源于HeLa细胞的total RNA 100ng为模板,使用ReverTra Ace® qPCR RT Kit(蓝线)及另外添附RNase H的B公司cDNA合成试剂盒,按各自推荐的实验步骤进行逆转录反应(B公司试剂盒分别按RNase H处理(红线)/未处理(橙线)两种方法进行)。然后,按和实验例1同样的方法检测β-Actin的扩增效果。结果显示,用B公司的试剂盒RNase H未处理(橙线)的情况下,检测效果大幅下降。而用ReverTra Ace® qPCR RT Kit(蓝线)进行反应,即便不追加RNase H处理也能显示出很高的扩增效率。已经过实验证明,用本试剂盒RNase H处理与否灵敏度相等。
※本试剂盒不包含RNase H处理步骤。





4.与其他公司预混型cDNA合成试剂的逆转录效率(cDNA合成量)的比

以HeLa total RNA 100ng为模板,按各公司试剂盒推荐条件进行逆转录,然后进行Realtime PCR对5种目的基因进行定量。结果显示,使用本试剂盒的cDNA得率更高。 




●cDNA合成
试剂:ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix(Code No.FSQ-201)及其他公司同类(预混型)产品
模板:HeLa total RNA 100ng /10μl反应体系
条件:按各公司试剂盒推荐的条件进行实验


●Realtime PCR
试剂:THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix(Code No.QPS-201)
模板:上述cDNA 2μl/20μl反应体系(添加量10%)
Target:有代表性的5种基因
测定:Applied Biosystems 7900HT




 

参考文献

1)M. Hatta et al., Intl. J. Mol. Med., 9: 147-152(2002)
2)K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219-2226(2003)
3)A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59-66(2002)
4)S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241-246(2002)
5)S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453-5460(2001)
6)Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666-675(2000)
7)S.Lee et al.,Gene,245:253-266(2000) 

产品内容

[FSQ-101]

5x RT Buffer 400μl

Enzyme Mix 100μl

Primer Mix 100μl

Nuclease-free Water 1000μl×2支



[FSQ-201]

5x RT Master Mix 400μl×1支

5x RT Master Mix no-RT Control 40μl×1支

Nuclease-free Water 1,000μl×2支



※各试剂盒均为10μl反应体系情况下,可以使用200次。

注意事项

本试剂盒中附带的5x RT Master Mix 及 5x RT Master Mix no-RT Control不能用在本公司的姊妹产品 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Code No. FSQ-301)中〔组分不同〕。
请务必注意。

基本反应条件

[FSQ-101]
将RNA置于65℃,5min.

置于冰上


灭菌蒸馏水 X μl
5x RT Buffer 2 μl
Enzyme Mix 0.5 μl
Primer Mix 0.5 μl
RNA 0.5pg1μg
Total Volume 10 μl

37℃, 15min.
98℃, 5min.


[FSQ-201]
将RNA置于65℃,5min.

置于冰上


Nuclease-free Water  Xμl
5x RT Master Mix    2μl
RNA template  1pg1μg
Total volume      10μl

37℃, 10min.
50℃,  5min.
98℃,  5min.
4℃,   hold.

几点建议

●反应时间延长的效果

像tRNA等含量较多的RNA全部进行逆转录反应时,延长反应时间可提高得率,但一般情况下推荐37℃15分钟可得到足够的cDNA。


●可以使用的模板RNA的种类

Total RNA、mRNA、tRNA、rRNA等各种RNA都可以使用。



●无需RNase H处理

由于模板RNA的残留会对PCR产生抑制作用,一般情况下,逆转录反应结束后需通过RNase H对模板RNA进行分解。但本试剂盒采用了本公司新开发的体系,模板RNA在逆转录反应后通过非酶方法去除(正在申请专利),因此逆转录反应后无需进行RNase H处理。


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