一步法RT-PCR试剂盒。与原来产品相比,检测灵敏度提高了大约100倍。

One-step RT-PCR 试剂盒 RT-PCR Quick Master Mix

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价格表

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PCR-311 50次份 RMB1,800 -20℃ 产品说明书

用途


●RT-PCR


说明

本产品是使用rTth DNA Polymerase 的单酶・一步法RT-PCR试剂盒。
采用了热启动法,可进行高灵敏度的检测。
在Mn2+存在的条件下,Tth DNA polymerase是具有逆转率活性的独特的酶,使用该酶,可在同一管内连续进行cDNA的合成反应及PCR。
本试剂是深受好评的一步法RT-PCR试剂盒「RT-PCR high -Plus- <<逆转录一次成功>>」的升级版,性能得到了极大提高,更加适用于各种用途。


 

实验例

1. 与本公司原来产品灵敏度的比较

使用试剂盒里添加的阳性对照RNA*与引物对,以约450bp人的G3PDH mRNA的区域为目的片段进行RT-PCR。

结果显示,RT-PCR Quick Master Mix与本公司原来的产品相比,灵敏度提高了100倍。


B: 空白对照
【样品】人G3PDH mRNA* (106 ~ 102拷贝/50μl反应体系)
*通过in vivo transcription法配制。
【引物】
Primer(F): 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (20mer)
Primer(R): 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (20mer)
【循环条件】
90℃ 0:30 →60℃ 30:00 →94℃ 1:00
→ (94℃ 0:30 → 60℃ 0:30 → 72℃ 1:00) x 40循环→72℃ 1:00

2. 使用mRNA进行cdc2基因的检测

人培养细胞来源的mRNA(5ng、0.5ng)为模板,以人的cdc2的ORF全(约900bp)为目的片段进行RT-PCR。
cdc2基因编码细胞周期相关的蛋白质。
结果显示,用本公司原来的产品不能检测的目的片段,用RT-PCR Quick Master Mix进行反应时,得到了良好的扩增结果。


【引物】
Cdc2-F : 5'-CCATACCATTGACTAACTATGGAAGAT-3' (27mer)
Cdc2-R : 5'-GTCAGAAAGCTACATCTTCTTAATCTG -3' (27mer)
            
【循环条件】
90℃ 0:30 →60℃ 30:00 →94℃ 1:00
→(94℃ 0:30 → 60℃ 0:30 → 72℃ 1:00) x 40循环→72℃ 1:00





 

参考文献

1)T. M. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)

产品内容

2×RT-PCR Quick Master Mix 625μl×2
50mM Mn(OAc)2 200μl
Nuclease-free Water 1100μl
Positive Control RNA 50μl
Control Primer F 50μl(10pmoles/μl)
Control Primer R 50μl(10pmoles/μl)

基本反应条件

灭菌蒸馏水 Xμl
2×Master Mix  25μl
50mM Mn(0Ac)2  2.5μl
各Primer 10pmoles each
RNA样品
  Total RNA  <2.5μg
  Poly(A)+ RNA < 500 n g
Total Volume 50μl

Cycle
90℃, 30sec.
60℃, 30min.

94℃, 1min.

94℃, 30sec.
50~70℃ 30sec. 30~40Cycles
72℃, 1min.

72℃, 7min.

※考虑退火温度、引物的Tm值,可在50~70℃之间进行调整。


几点建议

物的设计
RT-PCR用引物设计方法 在这里 进行介绍。


逆转录反应时的
PCR用的Reverse Primer直接当作逆转录用的引物。
无需另外添加。另外,不能使用Oligo dT或Random Primer。


●RT-PCR物的克隆
试剂盒在Mn2+在时可进行PCR,与使用Mg2+通常的PCR相比,保真性进一步降低了。因此,本产品适合于克隆PCR。

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