具有逆转录活性的独特PCR聚合酶。

rTth DNA Polymerase

  • NEW ITEM

价格表

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
TTH-301 250U×1支(100~200次份) RMB350 -20℃ -

用途

PCRRT-PCR

说明

本酶是来源于高度嗜热菌Thermus thermophilus HB8的耐热性DNA 聚合酶,经大肠杆菌表达生成的重组型酶。
本酶具有逆转录活性,该活性Mn2+存在的情况下会得到强化。利用该性能,可以用同一酶在同一试管中进行逆转录反应和PCR反应。
另外,本酶耐热性比Taq DNA 聚合酶高,对GC含量丰富的目的片段的扩增效率更出色。


 

特征

高效
与Taq DNA聚合酶相比,该酶对GC含量丰富的目的片段及粗样品的扩增效率更出色。


1体系完成RT-PCR
由于本酶在Mn2+存在条件下显示RTase活性,只用本酶即可完成 RT-PCR。
本酶在60℃时可进行RT反应,因此适用于GC含量丰富的目的片段、容易形成高级结构的目的片段的扩增。

 

实验例

1.使用Tth DNA Polymerase进行基因组PCR扩增

使用本酶,以50ng人的基因组为模板,进行PCR扩增长度180bp〜1.3kb的目的片段。
结果可见,各模板都得到了良好的扩增。

使用本酶可对各种目的片段进行PCR扩增。




2. 使用rTth DNA Polymerase进行RT-PCR的实验

使用本酶,以酵母Total RNA 1μg为模板,对actin(目的片段长180bp和300bp)进行RT-PCR、以及分别以人的Total RNA(100pg、10pg)对易于形成二级结构的18S rRNA(380bp)进行RT-PCR。
另外,对18S rRNA使用M-MLV RTase + Taq DNA Polymerase进行RT-PCR并进行了比较。


RT反应条件
含有0.2mM dNTPs、1mM MnCl2、Reverse Primer 2pmoles/μl、10U RNase Inhibitor及 5U rTth DNA Polymerase的RT Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.3)、90mM KCl)20μl反应液,60℃、30min.进行反应。


PCR条件
按1×浓度添加10×Chelating Buffer(100mM Tris-HCl(pH8.3)、1M KCl、7.5mM EGTA、0.5% Tween20),然后添加Forward Primer,使终浓度0.4pmoles/μl、MgCl2使用终浓度为1.88mM,以终体积100μl的反应体系进行循环。



结果显示,可以得到良好的RT-PCR结果。另外,可以确认:以易于形成二级结果的rRNA为模板进行RT-PCR,60℃条件下进行RT反应rTth DNA Polymerase比在42℃条件下进行RT的M-MLV RTase能得到更强的扩增效果。
这次虽然是使用的rTth DNA Polymerase,但是使用Tth DNA Polymerase也没有问题。
另外,一步法反应中进行RT和PCR反应时,推荐使用本酶的试剂盒RT-PCR Quick Master Mix」。






 

参考文献

1) T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)
2) K. Yamada et al., J. Biochem.(Tokyo), 130: 335-340(2001)

产品内容

Tth DNA Polymerase(5U/μl)  50μl
10×Buffer[TTH-3R]  1ml
Dilution Buffer[TTH-3D]  1ml
2mM dNTPs[NTP-201]* 1ml

*用本酶进行PCR时,请使用dNTPs[NTP-201]。其他的dNTPs,有时不能充分发挥PCR性能。

 
组分:
10mM Tris-HCl(pH7.5)
300mM KCl
0.1mM EDTA
1mM DTT
1% Triton® X-100
500μg/ml BSA
50% Glycerol

10×Buffer组成:
100mM Tris-HCl(pH8.9)
800mM KCl
15mM MgCl2
1% Triton® X-100
1% 胆酸钠
5mg/ml BSA

Dilution Buffer组分:
与组分相同。

活性的定义:
在75℃活性测定条件下,在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。

来源:
E.coli 重组体 


注意事项

*酶溶液中虽然含有消防法危险物 第4类 易燃液体 第3石油类 属于水溶性液体的50%的甘油,但是已确认在着火点测试实验中不属于危险物。


几点建议

●PCR产物的克隆
使用本酶得到的PCR产物,与Taq DNA 聚合酶相同,可通过TA克隆进行克隆。因本酶具有校正活性,PCR时的保真性在Mg2+存在条件下与Taq DNA 聚合酶大致相同。
可使用高效率TA克隆试剂盒「TArget CloneTM」进行实验。

●PCR条件的设定
基本上与Taq DNA聚合酶反应条件相同。不能扩增时,从变性到退火的过程中,设定1sec./1℃的坡度,有时比较好。

●RT-PCR反应
本酶在Mn2+存在条件下,虽然使用单酶可完成逆转录反应与PCR,但是保真性会下降,所以不适用于RT-PCR产物的测序或克隆目的的实验。


相关产品

(另外销售的包装)

品名 Code No. 包装 价格 保存温度 说明书下载
rTth DNA Polymerase用Buffer TTH-3R 1ml×1支 RMB 50 -20℃ -
rTth DNA Polymerase用Dilution Buffer TTH-3D 1ml×1支 RMB 50 -20℃ -
dNTPs Mixture(2mM) NTP-201 各2umoles/1.0ml × 1支 RMB 65 -20℃ -

●高效率TA克隆试剂盒

品名 Code No. 包装 价格 保存温度 说明书下载
TArget Clone™ TAK-101 10次份 × 1支 RMB 300 -20℃ 产品说明书

●使用Tth聚合酶的一步法RT-PCR试剂盒

品名 Code No. 包装 价格 保存温度 说明书下载
RT-PCR Quick Master Mix PCR-311 50次份 RMB 1,800 -20℃ 产品说明书