带有去除基因组功能的Realtime PCR用 cDNA合成试剂盒 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover

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价格表

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
FSQ-301 200次份 RMB 2,800 -20℃ 产品说明书

用途

Realtime PCR cDNA合成


说明

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)是使用高效率逆转录酶ReverTra Ace®开发的Realtime PCR用的逆转录试剂盒是含有逆转录反应必需的全部组分的5x浓度的完全预混型试剂,只要添加模板RNA与水,就能迅速地开始反应另外添加了能强力分解DNA的gDNA Remover,在逆转录反应前对模板RNA进行处理,就可以简便地制备无基因组DNAcDNA最适用于待检测目的基因中存在假基因,或在跨越内含子位置不能设计引物,以及模板RNA中残存有基因组DNA污染等问题时的Realtime PCR实验



 

特征

Realtime PCR试剂的配合性良好

采用了对Realtime PCR反应体系影响最小的组分,即使在PCR中添加最多20%的逆转录反应液,也可以得到很高的直线相关性。最适用于表达量低的mRNA的高灵敏度检测。


简便迅速地去除基因组DNA

只要依次添加去除基因组DNA的试剂和逆转录反应试剂,约20分钟就可以制得不含基因组DNA的cDNA。


完全预混型试剂

本品为放置于-20℃也不会冻结的完全预混型试剂。只要添加模板RNA和水,就可以简便高效率地合成cDNA,且重复性良好。


容易配制逆转录反应的阴性对照

因为添附有相同的预混型no-RT对照,能够方便地配制逆转录反应的阴性对照。


可得到更广的可定量扩增区域

将Oligo dT 与Random Primer按最适比例预混,可均一、高效地在RNA全序列范围内进行逆转录,因此可得到更广的可定量扩增区域。

 

实验例

1. gDNA Remover对基因组DNA去除效果的确认

为了确认gDNA Remover对基因组DNA的去除效果,按以下条件进行了逆转录反应,接着以β-Actin为目的基因进行Realtime PCR。结果显示,用gDNA Remover处理(+)、逆转录(-)<以下③>的条件时,没有扩增出现,可以确认基因组DNA已被去除掉。

●cDNA合成
试剂:ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover
模板:自己制备的HeLa total RNA 0.5μg /10μl反应体系
条件:使用gDNA Remover添加(+)、或无添加(-)的4x DN Master Mix,进行gDNA去除反应之后,分别用5x RT Master Mix II或5x RT Master Mix II no-RT Control进行逆转录反应。


●Realtime PCR
试剂:THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code No.QPS-201)
模板:上述cDNA2μl/20μl反应体系(添加量10%)
Target:ACTB(188bp)
測定:Applied Biosystems 7900HT


2.与其他公司同类型产品基因组DNA去除能力的比较

在HeLa total RNA中添加过量的人基因组DNA,与其他公司同类型试剂盒进行基因组DNA去除能力的比较模拟实验。结果显示,ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover在基因组DNA去除方面效果更加明显。


●cDNA合成
试剂:ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No.FSQ-301)及同类型其他公司的试剂盒2种
模板:HeLa total RNA(0, 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng, 100ng, 1μg)+ 人 gDNA 100ng/20ul反应体系
条件:按各公司试剂盒的推荐条件进行


●Realtime PCR
试剂:THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix(Code No.QPS-201)
模板:上述cDNA 2μl/20μl反应体系(添加量10%)
Target:ACTB(188bp)
测定:Applied Biosystems 7900HT





 

参考文献

1)K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226(2003)
2)A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66(2002)
3)S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246(2002)
4)S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460(2001)
5)Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675(2000)
6)S.Lee et al.,Gene,245:253−266(2000)

产品内容

gDNA Remover 10μl×1支
4x DN Master Mix 440μl×1支
5x RT Master Mix II 400μl×1支
5x RT Master Mix II
no-RT Control [FSQ-301NC] 40μl×1支
Nuclease-free Water 1,000μl×2支


※10μl反应体系情况下,可以使用200次。

注意事项

本试剂盒中附带的5x RT Master Mix II与本公司的姊妹产品ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix(Code No.FSQ-201)中含有的5x RT Master Mix组成不同。
请务必使用本试剂盒附带的5x RT Master Mix II。

基本反应条件

(RNA的变性)
RNA在65℃处理5min.

置于冰上
(gDNA去除反应(DNase反应))
Nuclease-free Water  Xμl
4x DN Master Mix
(gDNA Remover 添加完毕)  2μl
RNA template  0.5pg~0.5μg
Total volume  8μl

37℃, 5min.
(4℃)


(cDNA合成)
上述反应液  8μl
5x RT Master Mix II  2μl
Total volume  10μl

37℃, 15min.
98℃, 5min.
  4℃, hold.

几点建议

●反应时间延长的效果

像tRNA等含量较多的RNA全部进行逆转录反应时,延长反应时间可提高得率,但一般情况下推荐37℃15分钟可得到足够的cDNA。


●可以使用的模板RNA的种类

Total RNA、mRNA、tRNA、rRNA等各种RNA都可以使用。



●无需RNase H处理

由于模板RNA的残留会对PCR产生抑制作用,一般情况下,逆转录反应结束后需通过RNase H对模板RNA进行分解。但本试剂盒采用了本公司新开发的体系,模板RNA在逆转录反应后通过非酶方法(正在申请专利),因此逆转录反应后无需进行RNase H处理。

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