可简便地在短时间内从培养细胞开始制备荧光定量PCR用的模板cDNA

Realtime PCR用细胞溶解&cDNA合成试剂盒(用于培养的细胞) SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR

  • NEW ITEM

价格表

SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
SCQ-101 100次份 RMB 4,800 -20℃ 产品说明书
SCQ-101S 20次份 RMB 1,000 -20℃ 产品说明书

SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
SCQ-201 100次份 RMB 2,400 -20℃ 产品说明书
SCQ-201S 20次份 RMB 500 -20℃ 产品说明书

用途

Realtime PCR cDNA合成

说明

SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)是通过荧光定量PCR进行基因表达分析用的、由细胞裂解试剂(Lysis Reagents)和逆转录反应试剂(RT Reagents)组成的试剂盒。使用本产品,可以从用96孔板等培养的细胞开始,简便地制备含有能用作逆转录模板的RNA的细胞裂解物。而且,本试剂盒中含有的逆转录反应试剂,针对于从该细胞裂解物开始的逆转录反应进行了优化。使用本试剂盒,可以简便、迅速地从培养细胞开始合成荧光定量PCR用的模板cDNA,可用于高通量分析。

SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-201)是单独销售的细胞裂解试剂(Lysis Reagents)。可以使用本公司的RNA-directTM Realtime PCR Master Mix(Code No. QRT-101, QRT-201)等1-step法Realtime PCR试剂进行分析(简易测定)。



 

特征

●无需纯RNA

细胞用PBS(-)洗净后,向细胞中添加Lysis Solution (添加gDNA Remover),悬浊,室温温育5分钟,即可同时进行细胞裂解和基因组DNA的分解。反应停止只要添加Stop Solution处理即可,无需热处理。

逆转录反应时,添加细胞裂解物(不要稀释),温育25分钟。


●从裂解物开始合成高品质的cDNA

通过优化的buffer组成,有效地抑制了因RNase等的细胞成分引起的RNA的降解,将cDNA合成中夹杂成分的影响降至最低(制备RNA可在冰上稳定保持2小时)。另外,因为用DNase I处理后再进行cDNA的合成,所以可以合成基因组DNA污染少的高质量的cDNA。逆转录试剂是用本公司的高效率逆转录酶「ReverTra Ace®」进一步优化后的Master Mix,可简便、高效率地合成cDNA。合成cDNA可长期保存。

本试剂可用于多种类型的细胞的分析。已经确认下表中的代表性细胞可适用于本品。

*Master MixRandom 引物和Oligo dT引物按最适比例进行了混合。



细胞名称

贴壁/悬浮

细胞

1

A431

贴壁

H.sapiens

epidermoid carcinoma cell line

上皮样细胞癌

2

C2C12

贴壁

M. musculus

myoblast cell line

肌细胞

3

Caco-2

贴壁

H.sapiens

colon adenocarcinoma cell line

大肠

4

CHO-K1

贴壁

C. griseus

ovary cell line

卵巢

5

COLO205

悬浮

H.sapiens

colon adenocarcinoma cell line

大肠

6

DLD-1

贴壁

H.sapiens

colon adenocarcinoma cell line

大肠

7

HCT-15

贴壁

H.sapiens

colon adenocarcinoma cell line

大肠

8

HDF

贴壁

H.sapiens

primary foreskin fibroblasts (primary cell)

皮肤纤维芽细胞

9

HEK293

贴壁

H.sapiens

embryonic kidney  cell line

儿肾

10

HeLa S3

贴壁

H.sapiens

cervix carcinoma cell line

11

HepG2

贴壁

H.sapiens

hepatocellular carcinoma cell line

 

 

 

 

 

 

12

Jurkat

悬浮

H.sapiens

T lymphocyte cell line

血病T细胞

13

K562

悬浮

H.sapiens

myelogenous leukemia cell line

成红细胞样白血病细胞

14

KUSA-A1

贴壁

M. musculus

bone marrow stromal stem cell line

成骨细胞样细胞系

15

L929

贴壁

M. musculus

aneuploid fibrosarcoma cell line

结缔组织

16

MCF7

贴壁

H.sapiens

breast adenocarcinoma cell line

乳腺癌

17

Neuro2a

贴壁

M. musculus

neuroblastoma cell line

神经细胞瘤

18

NIH-3T3

贴壁

M. musculus

embryo fibroblast cell line

胎仔纤维芽细胞

19

PC12

贴壁

R. norvegicus

adrenal pheochromocytoma cell line

肾上腺褐色细胞瘤

20

rMSC

贴壁

R. norvegicus

bone marrow stromal stem cells

(primary cell)

骨髓间质细胞

21

THP-1

悬浮

H.sapiens

acute monocytic leukemia cell line

单核细胞

22

U937

悬浮

H.sapiens

leukemic monocyte lymphoma cell line

单核细胞


●降低了高通量分析时的误差

按照本操作步骤,移液分管及稀释操作步骤减少,降低了高通量分析时的误差。另外,细胞裂解时无需用移液枪头上下吹打混匀,而且同时可进行DNase I处理,提高了操作性。只要加入Stop Solution就可以终止DNase I的反应,无需引起RNA不稳定的加热操作。


●可以与各种荧光定量PCR试剂组合使用

可以与各种各样的荧光定量PCR试剂(SYBR® Green I, TaqMan® assay两种都可以)组合使用。

另外,与本公司THUNDERBIRD® qPCR Mix (Code: QPS-101, QPS-201)等组合使用,已确认可以从培养细胞开始简便且高度准确的进行基因表达分析。而且,与本公司的RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101, QRT-201)等的1-step荧光定量PCR试剂组合使用 进行简易的分析。


 

实验例

1. 纯化RNA与细胞裂解物的Ct值相关性的检验

使用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR,从2.5×104HEK293细胞开始合成cDNA(40ul反应体系)。另外,从HEK293细胞抽提的Total RNA 66.6ng开始,用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201),进行cDNA的合成(40ul反应体系)。

之后,以分别的cDNA为模板,使用THUNDERBIRD SYBR qPCR (Code No. QPS-201),15种管家基因进行荧光定量PCR,检验得到的Ct值的相关性。

结果表明,这次分析的15种基因,纯化RNA与使用细胞裂解物分析得到的结果具有良好的相关性。



2. 将数据的误差考虑在内的分析体系的质量评价

HeLa S3细胞铺板于96孔板中,每孔加2×104个细胞,加100mMPMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)培养24小时。之后,用PBS(-)洗涤PMA处理过的12个孔、未处理的12个孔,用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR处理后进行cDNA的合成。以得到的cDNA为模板,使用THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101),IL-6、IL-1β、β-actin基因进行TaqMan探针分析(n=12进行实验)。同样,使用A公司的对等产品进行荧光定量PCR(逆转录与荧光定量PCR试剂也是A公司试剂盒里附带的产品)IL-6、IL-1β基因的Ct值用β-actin基因进行校正(△Ct), 计算PMA处理前后的差(△△Ct)。

接着计算出Z’-factor并进行比较。




结果显示,两者的Z’-factor均超过了作为分析体系质量标准的0.5,但是使用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCRTHUNDERBIRD Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101)的实验中,与A公司的对等产品相比,显示出更高的Z’-factor,可见这是一种误差更少的良好的分析体系。




3. RNase活性强的细胞分析效率的验证

单细胞来源的细胞株U937RNase活性相对较高,使用细胞裂解液分析困难。

本实验中,用分别从1×104,1×103,1×102,1×10U937细胞制备的细胞裂解物8ul,进行cDNA的合成(40ul反应体系),反应后,使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Code No. QPS-201),β-actin基因进行荧光定量PCR。

同样,使用A公司的同类品进行同样的分析(逆转录与荧光定量PCR试剂也是使用A公司试剂盒附带的产品)。

另外,使用从同样的样品纯化的相当量的Total RNA进行分析(使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix [Code No. FSQ-201],THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix [Code No. QPS-201])。

结果显示,只有用本公司的产品分析,才能得到与使用纯化的RNA时相同的很高的线性相关性。




4.悬浮细胞的96孔板分析及基因表达分析的实验例

详细信息请参考这里(UPLOAD VOL. 102的链接)pdf文件打开。




 
产品内容

【SCQ-101】

(Lysis Reagents)

・Lysis Solution 5.5ml

・Stop Solution 1100μl

・gDNA Remover 33μl

・RNase Inhibitor 55μl


(RT Reagents)

5 x RT Master Mix 860μl

5 x RT Master Mix no-RT

  control                    86μl

Nuclease free Water 1000μl×3


【SCQ-201】

Lysis Solution 5.5ml

Stop Solution 1100μl

gDNA Remover 33μl

RNase Inhibitor 55μl



基本反应条件

用PBS(-)洗涤细胞

按以下比例(1个反应)向Lysis Solution中添加gDNA Remover

Lysis Solution  49.7μl

gDNA Remover 0.3μl

向有细胞的各孔中添加Lysis Solution (含有gDNA Remover)50μl

振荡30秒后,放室温孵育4分钟30秒

按以下比例(1个反应)向Stop Solution中添加RNase Inhibitor

Stop Solution    9.5μl

RNase Inhibitor 0.5μl

向各孔中添加Stop Solution(含有RNase Inhibitor)10μl

振荡30秒后,室温孵育1分钟30秒

置于冰上



<逆转录(RT)反应>

按以下比例(1个反应)在冰上制备RT Master Mix。

5x RT Master Mix        8μl

Nuclease-free Water  24μl

每孔分装32μl

添加裂解液8μl

37℃, 15min.

50℃,   5min.

98℃,   5min.(使酶失活)

  4℃,    Hold.

几点建议

●一次能够处理的细胞数量

细胞数过多,有可能不能充分裂解,会引起对RT-PCR的抑制、基因组DNA不能完全降解。本试剂一般能够处理10~7×104个细胞的细胞样品,但因细胞种类不同,多少会不同。推荐以104个细胞为标准,通过预实验确认细胞数量的上限。


●含有RNA的裂解物的稳定性

细胞种类不同,有可能RNase的活性较强、处理后仍然残存RNase活性,所以推荐立刻进行逆转录(RT)反应,转化为cDNA。实验暂时中断时,将样品移至冰上等待。等待时间请以2小时为标准。


FAQ请点击这里

相关产品

●2-step 高效率Realtime PCR Master Mix

品名 Code No. 包装 价格 保存温度 说明书下载
KOD SYBR® qPCR Mix QKD-201 1.67ml× 3支 RMB 2,450 -20℃ 产品说明书
THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix QPS-101 1.67ml× 3支 RMB 1,500 -20℃ 产品说明书
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix Without Rox QPS-201 1.67ml× 3支 RMB 1,500 -20℃ -
Realtime PCR Master Mix QPK-101 1ml× 5支 RMB 1,500 -20℃ 产品说明书
SYBR® Green Realtime PCR Master Mix QPK-201 1ml× 5支 RMB 1,500 -20℃ 产品说明书
SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus- QPK-212 1ml× 5支 RMB 1,600 -20℃ 产品说明书

●1-step qRT-PCR Mix

品名 Code No. 包装 价格 保存温度 说明书下载
RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix QRT-101 0.5ml× 5支 RMB 2,000 -20℃ 产品说明书
RNA-direct™ SYBR® Green Realtime PCR Master Mix QRT-201 0.5ml× 5支 RMB 2,000 -20℃ 产品说明书