改善循环后半段的扩增停滞现象。通过缩短延伸时间(30 sec/kb)实现理想的克隆PCR。

高保真・高效率・高速PCR酶 KOD -Plus- Neo

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价格表

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
KOD-401 200U×1支 RMB 1,000 -20℃ 产品说明书
KOD-401S 20U×1支 RMB 150 -20℃ 产品说明书

用途

PCR


说明

KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶KOD -Plus-系列技术的基础上,应用了本公司新开发的「延伸增强剂」,保持了KOD -Plus-系列高保真性(约为Taq的80倍)的同时,通过抑制<停滞现象>,明显提高了对微量模板DNA、长目的片段的扩增效率。



 

特征

●可对微量模板DNA进行高保真・高效率的扩增

通过应用延伸增强剂技术,即便是微量模板DNA也可对目的基因进行高保真・高效率的扩增。同时本酶具备高保真性(约为Taq的80倍),可准确地对低拷贝数模板的目的基因进行扩增。

PCR错配率是通过使用各种酶以人基因组DNA为模板扩增β-globin基因(2.4kb),对PCR产物进行TA克隆后,对96个克隆进行测序分析,测得的结果。


●缩短了延伸时间<30sec./kb>(长目的片段更方便)

延伸时间从原产品的60sec./kb缩短到30sec./kb。对长目的片段的扩增更加方便。



●实现了各种引物同一循环条件

20mer以上的引物(Tm值>63℃)可先尝试2步法。循环条件无需探讨非常简便。(请参考基本反应条件)
*Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。



●长目的片段的扩增
提高了延伸性,可对各种长度的目的片段进行扩增。已通过实验确认可对24kb的基因组DNA进行扩增。


●采用热启动法,提高了PCR性能

 

原理

KOD DNA polymerase具有强有力的3’→5’核酸外切酶活性(校正活性),可准确地对目的片段进行扩增,作为克隆用PCR酶获得了广泛的好评。 然而,高保真性PCR酶在20〜30循环以后,容易出现扩增无法持续的<停滞现象>。


KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶:KOD -Plus-系列技术的基础上,应用了本公司新开发的「延伸增强剂」,保持了KOD -Plus-系列高保真性(约为Taq的80倍)的同时,通过抑制<停滞现象>,明显提高了对微量模板DNA、长目的片段的扩增效率。


实验例

1. Total RNA的各种基因全长ORF的扩增

以HeLa细胞来源的Total RNA逆转录后得到的cDNA(Total RNA 50 ng相当)为模板, 对各种蛋白激酶的ORF(open reading frame)的全长扩增。反应根据各PCR酶的推荐条件进行了30个循环。结果可见,只有用KOD -Plus- Neo的情况下,所有的基因都能得到明亮的扩增产物,所有的ORF都能迅速地进行克隆。



2. β-globin基因上各种长度区域的扩增效率・延伸性的比较

以人基因组DNA(50ng)为模板,对各种长度的β -globin 基因进行扩增。反应按各PCR 酶的推荐条件,进行了30个循环。结果显示,只有用KOD -Plus- Neo 的情况下,17.5 kb 的片段能确认得到明亮的条带。 而且,17.5 kb 以下的片段,用KOD -Plus- Neo 的得率要高得多。



 

参考文献

1) M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63 : 4504-4510 (1997)
2) H. Hashimoto et al., J. Biochem.(Tokyo), 125 : 983-986 (1999)
3) H. Mizuguchi et al., J. Biochem.(Tokyo), 126 : 762-768 (1999)
4) M. Nishioka et al., J. Biotechnol., 88 : 141-149 (2001)
5) H. Hashimoto et al., J. Mol. Biol., 306 : 469-77 (2001)
6) T. Imanaka et al., J. Chin. Inst.Chem. Engrs., 32 : 277-288 (2001)

产品内容

【KOD-401】
KOD -Plus- Neo (1U/μl)200μl ×1支
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo [KOD-4B]1ml ×1支
25mM MgSO4[KOD-2S]1ml ×1支
2mM dNTP [NTP-201]1ml ×1支

※50μl反应体系的情况下可使用200次。



组分:
50mM   Tris-HCl (pH8.0)
25mM   KCI
0.1mM  EDTA
1mM     DTT
0.05%    Tween®-20
0.05%    Nonidet®P-40
50%       Glycerol

活性的定义:

在75℃活性测定条件下,在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。



来源:

E.coli重组体

基本反应条件

灭菌蒸馏水X μl
2mM dNTPs5μl
25mM MgSO43μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
KOD -Plus- Neo (1.0U/μl)1μl
Genomic DNA~200ng
Plasmid DNA~50ng
cDNA~200ng(RNA相当)
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo5μl

Total Volume50μl


〈2 Step Cycle〉*
94℃    2min.
         ↓
98℃    10sec.
68℃    30sec./kb 25~45 cycles

〈3 Step Cycle〉*
94℃    2min.
        ↓
98℃    10sec.
Tm℃    30sec.
68℃    30sec./kb 25~45 cycles

〈Step Down Cycle〉*
94℃    2min.
        ↓
98℃    10sec.
74℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
72℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
70℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
68℃    30sec./kb 15~30 cycles
        ↓
68℃    7min.

*引物的Tm值高于63℃的情况下,请用两步法。
引物的Tm值在63℃以下,或用两步法无法确认到扩增时,请尝试用三步法。
此外,当扩增产物出现杂带或弥散时,请尝试Step down方法。


※Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。
引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具


几点建议

PCR产物的克隆
由于本酶的PCR产物已被平滑化,可用平滑末端克隆法进行克隆。此时,如已对载体进行了脱磷酸化处理,就需要对PCR产物进行磷酸化,或使用带5'磷酸基的引物。 

另外,由于本酶的PCR产物已被平滑化,不能直接进行TA克隆。可使用按以下方法开发的TA克隆专用试剂盒「TArget Clone -Plus-」。


PCR条件的设定
酶的标准使用量为50μl反应体系1U。延伸反应在68℃条件下进行,按1kb目的片段1min.的标准。出现拖尾条带时,可降低MgSO4浓度,无法确认到扩增时,可提高MgSO4浓度。

●高GC含量的模板

在反应液中添加终浓度为25%的DMSO可得到改善。

●以RT反应液为模板的情况

过量带入RT反应液有可能会对PCR反应产生抑制作用。建议带入到PCR的RT反应液在PCR反应液的1/25以下(最好在1/50以下)。这样就无需考虑RT反应液中Mg2+、dNTPs的影响,只要按照基本反应条件添加本酶中添付的dNTPs和MgSO4即可。 


●引物的设计
3'端有错配的引物,可能会受本酶校正。

FAQ请点击这里

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