KOD SYBR® qPCR Mix
实验例4:生物农药丝状菌的特异性检测及定量

【数据提供】
神戸大学大学院 农学研究科 生命机能化学专业 细胞机能构造学研究室
池田 健一 老师 ・ 宿南 良 
【实验结果】
1. 使用A公司qPCR试剂盒的结果
a. 扩增曲线

b. 融解曲线

2. 使用KOD SYBR® qPCR Mix的结果
a. 扩增曲线


b. 融解曲线

淡兰色: 5×10-13 g/μL
绿色: 5×10-12 g/μL
黄色: 5×10-11 g/μL
红色: 5×10-10 g/μL
紫色: 5×10-9  g/μL


【样品】 丝状菌基因组DNA
【样品的制备方法】 使用VIOGENE公司的Plant Genomic DNA Extraction Miniprep System试用盒从液体培养的菌体中提纯丝状菌基因组ムDNA。
【基因名】 rDNA ITS区域
【目的片段长度】 105bp
【引物序列】 F:碱基数19 Tm值53.9 R:碱基数20 Tm值58.4
【反应液组成】 KOD SYBR® qPCR Mix与A公司的荧光定量PCR试剂一起按以下组成进行实验。
 qPCR酶mix         10μL
 Primer F       2μL
 Primer R       2μL
 Template       1μL
 DDW          5μL
 反应液        20μL
【PCR循环】
® qPCR Mix>
98℃, 2min.
 ↓
(98℃, 10sec., 60℃, 10sec., 68℃, 30sec.)×45
 ↓
融解曲线分析 60℃ to 99℃
< A公司的qPCR试剂盒>
95℃, 10min.
 ↓
(95℃, 15sec., 60℃, 1min.)×40
 ↓
融解曲线分析 60℃ to 95℃
【检测仪器】
TAKARA Thermal Cycler Dice® Real Time System Single
【评论】
丝状菌的基因组DNA的抽提,因种类不同而生成的糖类的不同,抽提纯度也不一致。本实验中使用的丝状菌也因为生成了多糖,可以预测PCR扩增效率会下降。
本实验中,将本实验室一直使用的A公司的qPCR试剂盒(RNA表达分析中可以得到十分满意的结果)与KOD SYBR® qPCR Mix进行了扩增效率的比较。
扩增曲线分析中,同一模板浓度时大体上来说KOD SYBR® qPCR Mix的Ct值更低,可能提高检测灵性能。另外,虽然已确认模板浓度过高时,两者都会出现扩增效率下降的趋势,但是其中KOD SYBR® qPCR Mix会在更高浓度(红色=5×10-10g/μL)的模板时都能够扩增。
融解曲线分析中,也可以看到结果的改善。相比A公司的产品,KOD SYBR® qPCR Mix在样品方面的误差更小、扩增曲线的峰也大体一致。由此可见,它可以更加高保真地扩增目的基因。
关于KOD系列,本实验室一直使用KOD FX Neo对丝状菌进行转化后筛选。转化后的筛选必须要小规模迅速地进行检测。虽然通过一次筛选得到的菌落菌丝片段简单地进行基因组DNA的提取,通过PCR确认目的基因是否已插入,但是KOD FX Neo使用少量且粗样品(菌丝片段用微波炉照射3次,每次30秒处理后,取上清液使用)也可以得到稳定的阳性条带,所以是非常方便的。
通过这些使用情况,可以看出KOD SYBR® qPCR Mix及KOD FX Neo的buffer体系是相同的,对丝状菌提取的样品都具有良好的扩增效果。