KOD SYBR® qPCR Mix
实验例3:使用粗样品进行荧光定量PCR

【数据提供】
 日本大学 药学部 基因组制药学研究室 小林 秀昭 老师

【实验结果】 
1. 提纯的DNA及菌液的扩增曲线

 

  红色:提纯的DNA
  绿色:菌液

菌液的扩增曲线的斜率与提纯的DNA的斜率大致相同。

2. 提纯的DNA与菌液的融解曲线


红色:提纯的DNA
绿色:菌液

菌液的融解曲线的形状与提纯的DNA大致相同。峰也显示出相同的Tm,非特异性产物也基本没有产生。

【样品】菌液

【样品的制备方法】
取昆虫的一部分组织。捣碎研磨,回收其中存在的菌类。

【基因名】B

【目的片段长度】约600 bp

【引物】
     Primer1:24 mer, Tm 60℃、Primer2:24 mer, Tm 58℃

【比较对象】提纯的DNA

【反应条件】
  KOD SYBR® qPCR Master Mix      5μL
  Primer1 (10 μM)        0.2μL
  Primer2 (10 μM)        0.2μL
  50×ROX reference dye      0.2μL
  Template             1μL
  DDW                3.4μL  
  合计                10μL

【PCR循环】
 98℃, 2 min.
 ↓
 (98℃, 10 sec. - 60℃, 10 sec. - 68℃, 30 sec.) × 40 cycles
 ↓
 melt curve

【检测仪器】StepOne Plus (life technologies)

【评论】
与提纯的DNA相比,即使用菌液也几乎没有副产物的生成、Tm也一致、扩增曲线的斜率也大致相同,所以KOD SYBR® qPCR Mix对菌液等粗样品也可以进行扩增,例如菌落PCR等。