KOD SYBR® qPCR Mix
实验例2:基因组DNA的相对定量


【数据提供】
 日本大学 药学部 基因组制药学研究室 小林 秀昭 老师
【结果】
1. 融解曲线 (模板DNA 5ng)

用KOD SYBR® qPCR Mix的融解曲线只有一个峰,用A公司荧光定量PCR试剂得到了多个峰。
2. 扩增曲线

KOD SYBR® qPCR Mix与A公司的荧光定量PCR试剂都可以确认对样品进行了定量扩增。KOD SYBR® qPCR Mix的扩增起峰更早一些,另外,可以确认在达到平台期之前都是直线扩增的。与之相对,A公司的荧光定量PCR试剂,从中间开始斜率就变得比较缓和了。

【样品】基因组DNA

【基因名】A

【引物】 Primer1: 24mer, Tm 60℃、Primer2: 24mer, Tm 58℃

【目的片段长度】 533bp

【反应条件】
 ® qPCR Mix>
 KOD SYBR® qPCR Master Mix       5μL
 50×ROX reference dye        0.2μL
 Primer1 (10μM)          0.2μL
 Primer2 (10μM)          0.2μL
 模板DNA              1μL
 DDW                3.4μL 
 Total               10μL

 荧光定量PCR试剂>
 SYBR® Green Master Mix        5μL
 Primer1 (10μM)           0.2μL
 Primer2 (10μM)           0.2μL
 模板DNA                1 μL
 DDW                  3.6μL  
 Total                 10  μL

【PCR循环】
 ® qPCR Mix>
 98℃, 2 min.
 ↓
 (98℃, 10 sec. - 60℃, 10 sec. - 68℃, 30 sec) × 40 cycles
 ↓
 melt curve

 荧光定量PCR试剂>
 95℃, 20 sec.
 ↓
 (95℃, 3 sec. - 60℃, 30 sec.) × 40 cycles
 ↓
 melt curve

【检测仪器】 StepOnePlus (life technologies)

【评价】
KOD SYBR® qPCR Mix可以直接用PCR时使用的引物。因此感觉非常方便,用途也非常广泛。